CULTIVO E MEIO DE CULTURA

CULTIVO E MEIO DE CULTURA

MEIOS DE CULTURA
Sistema artificial contendo os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos. Para cultivar os microrganismos no laboratório é necessário fornecer-lhes nutrientes, incluídos nos meios de cultura, bem como, temperatura e atmosfera adequada ao seu crescimento.
Uma populaçao microbiana em crescimento em um meio de nutritivo, constitui uma cultura. A cultura de uma unica espécie é chamada “Cultura pura”. Todos os trabalhos em laboratorio sao baseados em culturas puras, pois permitem o estudo preciso da morfologia e fisiologia microbiana.
O desenvolvimento de microrganismos em um meio de cultura está relacionadao a fatores muito importantes como:
Disponibilidade de nutrientes;
Necessidade ou nao de oxigenaçao;
Grau de umidade;
Temperatura ideal e
Utilizaçao de técnicas assépticas.
Estes meios de cultura podem ser classificados de acordo com as seguintes características e/ou aplicações:
Consistência (presença de Agar): relacionada ao estado físico.
Os meios líquidos são úteis para a obtenção de grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas. Semeia-se (ou inocula-se) por agitação.
Os meios semi-sólidos contêm gelose (Agar) na concentração de até 1,0 %, permitem o crescimento no local de inoculação e a observação da motilidade. Semeia -se em picada com o fio (agulha de inoculação ou swab).
Os meios sólidos contêm gelose (Agar) na concentração de 1,5 % a 2%, são os mais indicados na obtenção de colônias isoladas (cultura pura). Quando em tubo de ensaio inclinado, semeia-se por estria longitudinal, porém quando em placa de petri semei-se em estria, pela técnica de esgotamento do inóculo ou por inundação (contagem de colónias).


Meios para o cultivo de bactérias: simulam o habitat natural das bactérias. Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc., possui o pH de 6,5 a 7,5.
Ex.: Brain Heart Infusion Agar – BHI Agar.

Meios para o cultivo de fungos: são misturas simples contendo glicose, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e alguns minerais. Em geral esses meios têm uma concentração maior de açúcar (4%) e um pH menor (3,8 a 5,6).
Ex.: Sabouraud Agar.

Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composição exata de tais meios. São preparados pela adição de quantidades precisas de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos purificados, juntamente a água destilada.

Meios complexos são meios que não fornecem compostos especiais sobre os microrganismos. Estes frequentemente empregam produtos da digestão de caseína (proteína do leite), carne, soja, levedura entre outras.

Meios de cultura simples ou básicos são meios onde somente são fornecidas moléculas ou fórmulas iônicas simples, podem ser naturais (leite, suco de tomate) ou artificiais (Agar simples, água peptonada). São destinados ao cultivo de germes pouco exigentes, ou servem de base para outros meios de cultura.

Meios enriquecidos são variações dos meios simples adicionados de substancias que melhoram o valor nutritivo, são empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos exigentes.
Ex.: Agar-sangue, Agar chocolate.

Meios Redutores são meios que empregam substancias oxi-redutoras que capturam substancias tóxicas para determinados microrganismos. Permite o crescimento de bactérias anaeróbias, por capturar o oxigênio livre.
Ex.: Caldo tioglicolato de sódio.

Meios de transporte são meios utilizados no caso de não ser possível realizar a cultura logo após a coleta do material biológico. Tem a finalidade de manter estável e viável a população microbiana presente no material.
Ex: salina tamponada, Stuart e Cary Blair.

Meios seletivos são desenvolvidos para promover o crescimento de determinado microrganismo de interesse, impedindo o crescimento de outros. A prática mais comum é a incorporação de substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal seleção.
Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para as Neisseria onde os organismos indesejáveis são inibidos pela colistina, nistatina, vancomicina e trimetroprim, Agar MacConkey que inibe os Gram positivos.

Meios diferenciais são desenvolvidos para facilitar a separação presuntiva de espécies de microrganismos. Esses meios permitem a obtenção de colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia, coloração, etc), de acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e indicadores incorporados ao meio.
Ex.: Agar MacConkey (permite diferenciar os fermentadores ou não da lactose), Agar Sangue (permite verificar o grau de hemólise).

Alguns meios seletivos podem ser também diferenciais. Ex Agar MacConkey, Agar Manitol Salgado (seletivo para os halotolerantes e diferenciais quanto a fermentação do manitol).

TÉCNICAS ASSÉPTICAS PARA O CULTIVO DE AMOSTRAS
Inoculação
Os meios de cultura devem ser esterilizados antes do uso, geralmente o método utilizado é o calor em autoclave. Uma vez que um meio de cultura tenha sido preparado, este pode receber um inoculo de uma cultura. Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura), é colocado dentro ou sobre um meio (Agar), as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia isolada. Mas para isto deve-se empregar técnicas assépticas para evitar a contaminação durante a sua manipulação. A transferência asséptica de uma cultura para outra é realizada com o auxilio de uma agulha de inoculação ou alça de platina, previamente esterilizada em uma chama.
Cada colônia resulta, em princípio, da multiplicação de uma só bactéria, pelo que diferentes espécies/géneros apresentarão colónias diferentes. Na generalidade, estas diferenças são mais visíveis em meios selectivos.
1. Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio.

2. Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na superfície do Agar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Drigalsky).
3. Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com Agar fundido a 45º C, que se verte em uma placa de Petri. Quando o Agar se solidifica, as células são nele imobilizadas e crescem, formando colônias.
CULTIVO DE AERÓBIOS
Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. Após a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes são mantidos em estufa a 37º C em presença de oxigênio do ar atmosférico. Sempre com as placas de petri no sentido invertido.
CULTIVO DE ANAERÓBIOS
Para o cultivo de microrganismos na ausência de oxigênio são utilizados meios reduzidos, que são meios de cultura com a adição de um agente redutor (ex.: tioglicolato de sódio), capaz de absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2.
Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono, pode ser utilizado também uma vela acessa. Este sistema é inadequado para o cultivo de anaeróbios estritos.
QUANTIFICAÇÃO DA POPULAÇÃO MICROBIANA
Os métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o número de células - UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL
Contagem celular microscópica ou eletrônica
Contagem em placa (diluição seriada da amostra, uso de alça calibrada ou membrana filtrante).
Conservação por um curto período (dias a meses):
Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4º C a 10º C)
Repiques freqüentes
Conservação por longos períodos:
Nitrogênio líquido a -196º C
Freezers a -70º C/ -120º C
Liofilização as amostras são congeladas, desidratadas e fechadas à vácuo, o que possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos.